活細(xì)胞分析儀通過自動化成像、環(huán)境控制與智能分析技術(shù)，可系統(tǒng)追蹤小鼠胚胎卵母細(xì)胞焦亡過程，其核心流程與功能如下：
一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：動態(tài)追蹤焦亡過程
1.樣本準(zhǔn)備
將小鼠胚胎卵母細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或微孔板中，置于活細(xì)胞分析儀的培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃、5% CO?），避免頻繁取出導(dǎo)致的環(huán)境干擾。
2.誘導(dǎo)焦亡
通過藥物（如LPS、化療藥物）或基因編輯（如敲除/過表達(dá)焦亡相關(guān)基因）誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，模擬生理或病理狀態(tài)。
3.定時(shí)成像
設(shè)置活細(xì)胞分析儀的拍攝間隔（如每30分鐘或1小時(shí)），連續(xù)記錄72小時(shí)以上的細(xì)胞動態(tài)變化，捕捉焦亡的關(guān)鍵事件（如膜起泡、破裂）。
二、多模態(tài)成像：捕捉焦亡形態(tài)特征
1.明場成像
細(xì)胞腫脹與膜破裂：光鏡下觀察細(xì)胞體積增大、氣泡狀突起（焦亡小體）及膜完整性喪失。
運(yùn)動軌跡：記錄細(xì)胞遷移或群體行為變化，分析焦亡對胚胎發(fā)育的影響。
2.熒光成像
膜標(biāo)記：用鈣黃綠素-AM標(biāo)記活細(xì)胞質(zhì)，Annexin V-FITC標(biāo)記早期焦亡細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸。
核標(biāo)記：Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核，觀察核濃縮、DNA斷裂等特征。
炎癥因子標(biāo)記：抗IL-1β-Alexa Fluor 647抗體標(biāo)記釋放的促炎因子，直觀顯示炎癥反應(yīng)。
3.三維Z軸堆疊
通過電動Z軸控制重建細(xì)胞或胚胎的三維結(jié)構(gòu)，分析焦亡過程中細(xì)胞內(nèi)部器官（如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）的腫脹與破裂。
三、智能分析：量化焦亡參數(shù)
1.形態(tài)學(xué)分析
AI識別：自動識別細(xì)胞邊界、焦亡小體數(shù)量及膜破裂時(shí)間。
面積變化率：計(jì)算細(xì)胞面積隨時(shí)間的變化，量化腫脹程度。
運(yùn)動軌跡追蹤：分析細(xì)胞遷移路徑，評估焦亡對胚胎動態(tài)的影響。
2.生化特征分析
炎癥小體激活：通過熒光信號定量檢測NLRP3、ASC等炎癥小體組件的組裝。
Caspase活化：Western Blot或熒光探針檢測Caspase-1/4/5/11的切割與激活。
Gasdermin蛋白切割：檢測GSDMD/GSDME的N端片段生成，確認(rèn)膜孔道形成。
3.炎癥因子釋放
ELISA檢測：定量分析培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18的濃度，評估炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。
多因子檢測：利用Luminex或MSD技術(shù)同時(shí)檢測多種炎癥因子，提高通量。
四、經(jīng)典與非經(jīng)典通路解析
1.經(jīng)典通路（Caspase-1依賴）
炎癥小體激活：NLRP3識別病原體或危險(xiǎn)信號，招募ASC與Caspase-1形成復(fù)合體。
Caspase-1切割：激活后切割GSDMD，產(chǎn)生N端片段形成膜孔道，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹破裂。
炎癥因子釋放：切割I(lǐng)L-1β/IL-18前體，成熟后釋放至細(xì)胞外，招募免疫細(xì)胞。
2.非經(jīng)典通路（Caspase-4/5/11依賴）
直接LPS識別：人源Caspase-4/5或鼠源Caspase-11直接結(jié)合細(xì)菌LPS，被激活后切割GSDMD。
間接Caspase-1激活：非經(jīng)典通路可間接激活Caspase-1，放大炎癥反應(yīng)。
Pannexin-1剪切：Caspase-11剪切Pannexin-1，誘導(dǎo)ATP釋放，進(jìn)一步加劇焦亡。
五、應(yīng)用場景與優(yōu)勢
1.胚胎發(fā)育研究
追蹤焦亡對胚胎植入前發(fā)育的影響，分析染色體分離異常與胚胎質(zhì)量的關(guān)系。
評估卵巢刺激對卵母細(xì)胞焦亡發(fā)生率的影響，優(yōu)化輔助生殖技術(shù)。
2.疾病機(jī)制研究
感染性疾病：研究病原體誘導(dǎo)的焦亡在抗感染免疫中的作用。
神經(jīng)退行性疾病：分析小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡在阿爾茨海默病中的雙重角色（清除病原體 vs. 引發(fā)炎癥）。
腫瘤免疫：探索化療藥物通過GSDME介導(dǎo)的焦亡在腫瘤清除中的機(jī)制。
3.技術(shù)優(yōu)勢
長時(shí)間連續(xù)監(jiān)測：72小時(shí)以上穩(wěn)定運(yùn)行，捕捉快速動態(tài)過程。
低光毒性設(shè)計(jì)：紅色LED光源減少光損傷，支持長時(shí)間成像。
高通量分析：96孔板自動掃描，單次實(shí)驗(yàn)處理數(shù)百樣本。
AI智能分析：自動識別細(xì)胞形態(tài)、量化參數(shù)，減少人為誤差。
總結(jié)
活細(xì)胞小鼠胚胎卵母細(xì)胞的細(xì)胞焦亡系統(tǒng)，主要依賴炎癥小體（如 NLRP3）激活，下游 caspase-1/11 介導(dǎo)信號傳遞，促使 GSDMD 蛋白穿孔細(xì)胞膜，釋放促炎因子。該過程與卵母細(xì)胞發(fā)育階段相關(guān)，氧化損傷、病原體入侵等應(yīng)激可誘導(dǎo)其發(fā)生，參與卵母細(xì)胞質(zhì)量篩選，異常激活則可能影響胚胎發(fā)育潛力，是卵母細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)的重要調(diào)控機(jī)制。
