全內反射熒光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescence Microscope，TIRF Microscope）是一種高級熒光顯微鏡技術，它廣泛應用于生物學和生物醫學研究領域，允許科學家觀察細胞和分子的亞細胞結構和動態過程。以下將詳細介紹全內反射熒光顯微鏡的工作原理、應用領域以及優缺點。

工作原理

全內反射熒光顯微鏡的工作原理基于全內反射現象，該現象發生在兩種不同折射率的介質接觸面上，當光線從高折射率的介質射向低折射率的介質時，入射角大于所謂的全內反射臨界角時，光線將被完全反射。這一現象用于創建一種被稱為全內反射的光學現象。

TIRF顯微鏡的主要組成部分包括：

激光器： 通常使用激光器產生高強度、單色和相干的激光光束。

偏振器： 用于控制光的偏振狀態，以便在全內反射表面上引起TIRF效應。

物鏡： 物鏡具有高數值孔徑（Numerical Aperture，NA）以捕獲全內反射的光。

TIRF裝置： TIRF裝置通過改變入射角度，確保光線只在接觸面內全內反射，這樣只有非常薄的樣本層與激光相互作用。

熒光標記樣本： 樣本通常被標記上熒光標記物，這些標記物在TIRF條件下會產生熒光信號。

熒光檢測系統： 熒光信號被檢測、分離和成像，通常使用高靈敏度的CCD相機或光電倍增管（Photomultiplier Tubes，PMTs）。

工作過程

全內反射： 激光束通過偏振器，然后被物鏡聚焦在與樣本接觸的表面上。因物鏡的高NA，光線在表面內發生全內反射。

激發熒光： 僅有很薄的樣本層受到光的激發，這些樣本層中的熒光標記物被激發并發出熒光信號。

熒光檢測： 熒光信號通過熒光檢測系統捕獲、分離和成像。這提供了高對比度和高分辨率的圖像。

應用領域

細胞成像： TIRF顯微鏡用于觀察活細胞的表面和亞細胞結構，包括細胞膜、受體聚集、突觸傳輸和胞吞作用等。

膜蛋白研究： 用于研究膜蛋白在細胞膜上的分布和動力學，包括受體、通道蛋白等。

分子相互作用： TIRF可用于研究分子之間的相互作用，如蛋白質-蛋白質、蛋白質-核酸相互作用。

單分子熒光： 用于單分子級別的熒光研究，如單分子跟蹤和單分子光學成像。

優點

高分辨率： TIRF顯微鏡提供了高分辨率的圖像，使其適用于觀察亞細胞結構和分子過程。

無需染色： 全內反射條件下，樣本僅在接觸表面上被激發，因此不需要大量的熒光標記。

實時觀察： 適用于實時觀察動態過程，如細胞內部的活動。

缺點

樣本要求： 樣本需要在表面上緊密接觸，這可能限制了適用性。

復雜性： TIRF顯微鏡的設置和操作較為復雜，需要經驗和專業知識。

成本： 相對于傳統熒光顯微鏡，TIRF顯微鏡的價格較高。

總的來說，全內反射熒光顯微鏡是一種強大的工具，可用于研究細胞和分子層面的生物過程，尤其適用于需要高分辨率成像和實時觀察的研究。然而，它的復雜性和成本使得它主要在研究實驗室和高度專業化的應用中得到廣泛應用。