培養箱內的倒置熒光顯微鏡（Incubator-Integrated Inverted Fluorescence Microscope）是將倒置熒光顯微鏡核心光學系統與細胞培養箱的恒溫、恒濕、無菌（或控氣）環境深度集成的專用設備，核心價值是實現對活細胞 / 活組織的長時間、動態、高分辨率熒光成像，同時最大限度模擬體內生長環境以維持細胞活性。它是細胞生物學、發育生物學、腫瘤學等領域研究 “細胞實時行為”（如細胞遷移、分裂、凋亡、信號通路動態）的關鍵工具。

一、核心設計邏輯：為何需要 “培養箱內 + 倒置”？

傳統熒光顯微鏡與獨立培養箱的組合，存在兩大缺陷：① 細胞從培養箱取出觀察時，環境溫度、CO?濃度驟變，易導致細胞應激（如骨架收縮、代謝紊亂），無法反映真實生理狀態；② 短時觀察無法捕捉 “小時級” 甚至 “天級” 的動態過程（如細胞周期、病毒感染過程）。

而 “培養箱內倒置熒光顯微鏡” 通過以下設計解決這些問題：

“培養箱內” 集成：將顯微鏡的物鏡、載物臺、光源（部分）直接置于密閉培養環境中，細胞無需轉移，全程處于 37℃恒溫、5% CO?（維持 pH）、95% 濕度的穩定條件，避免環境波動對細胞活性的影響。

“倒置” 結構：與正置顯微鏡（物鏡在樣品上方）不同，倒置顯微鏡的物鏡位于載物臺下方，樣品（如培養皿、多孔板）直接放在載物臺上，物鏡從下方貼近樣品底面成像。這種設計的優勢在于：

兼容常規細胞培養容器（如 6 孔板、35mm 培養皿），無需特殊載玻片；

避免物鏡壓迫樣品或污染培養基，適合長時間靜置成像；

減少培養基表面反光對熒光信號的干擾，提升成像質量。

二、核心組成：光學系統與培養環境系統的協同

設備本質是 “光學成像模塊” 與 “環境控制模塊” 的一體化整合，各部分功能高度協同：

模塊分類 核心組件 功能作用

光學成像模塊 1. 熒光激發與發射系統 - 激發光源：LED 或汞燈，提供特定波長（如 488nm 激發 GFP、561nm 激發 RFP）；

- 濾光片組：精準分離激發光與發射光，避免激發光干擾熒光信號，確保特異性。

2. 物鏡 - 高數值孔徑（NA，如 1.4）的油鏡或水鏡，保證高分辨率（可達亞微米級，如 0.2μm）；

- 長工作距離設計，適配培養皿底面厚度（避免物鏡接觸培養基）。

3. 成像檢測器 - 電荷耦合器件（CCD）或互補金屬氧化物半導體（sCMOS）相機；

- 高靈敏度、低噪聲，可捕捉弱熒光信號（如低表達的熒光蛋白），支持快速動態成像（幀率達每秒數十幀）。

4. 自動對焦與掃描系統 - 自動對焦（AF）：通過紅外或激光反饋，實時補償樣品漂移（如培養皿輕微變形），保證長時間成像清晰度；

- 電動載物臺：支持多區域（如多孔板不同孔）、Z-stack（三維層掃）自動成像。

環境控制模塊 1. 溫度控制系統 - 加熱元件（載物臺、物鏡加熱套、腔室加熱）：精準控溫（37±0.1℃），避免物鏡與樣品溫差導致的結露或細胞溫度波動。

2. 氣體控制系統 - CO?傳感器與進氣閥：維持腔室 CO?濃度（通常 5%，適配含碳酸氫鈉的培養基），穩定培養基 pH 值；

- 部分設備支持 O?控制（如低氧 2%，模擬腫瘤微環境）。

3. 濕度控制系統 - 內置加濕盤或蒸汽發生器：維持 90%-95% 相對濕度，防止培養皿中培養基蒸發導致細胞脫水或滲透壓升高。

4. 無菌防護系統 - 腔室材質（不銹鋼 / 聚四氟乙烯）耐高溫消毒；

- 紫外燈（UV）定期殺菌，部分設備支持 HEPA 濾網過濾腔室空氣，減少污染風險。

三、關鍵技術指標：決定成像質量與細胞兼容性

選擇或評估該設備時，需重點關注以下指標，直接影響實驗結果的可靠性：

分辨率：由物鏡 NA 值和激發波長決定，常規活細胞成像需達到0.2-0.5μm（如觀察線粒體、細胞骨架）；若研究亞細胞結構（如囊泡運輸），需更高分辨率（如 0.1μm 級超高分辨模塊）。

熒光靈敏度：取決于檢測器（sCMOS 優于 CCD）和光學系統透光率，需能檢測到 “低表達熒光蛋白”（如弱啟動子驅動的 GFP），避免信號過弱導致漏檢。

環境控制精度：

溫度波動≤±0.1℃（溫差過大會影響細胞周期）；

CO?濃度波動≤±0.2%（濃度不穩定會導致培養基 pH 驟變，細胞死亡）；

濕度≥90%（防止培養基蒸發，尤其長時間（>24h）成像）。

時間分辨率：即成像間隔，可根據實驗需求調整（如細胞分裂觀察需每 5-10 分鐘拍 1 次，囊泡運輸需每秒拍 10-30 幀），設備需支持 “自動定時成像”（無需人工干預）。

樣品兼容性：需適配常規細胞培養容器，如 6/24/96 孔板、35mm/50mm 培養皿、共聚焦小室等，載物臺承重能力需滿足多層樣品或大型培養容器（如 Transwell）。

四、典型應用場景：聚焦 “活細胞動態過程” 研究

該設備的核心優勢是 “在細胞存活狀態下，實時追蹤熒光標記目標的動態變化”，常見應用包括：

細胞行為動態觀察：

細胞遷移：通過標記細胞骨架（如 GFP-actin），實時記錄細胞在基質上的遷移軌跡（如傷口愈合實驗、趨化實驗）；

細胞分裂：追蹤染色體（如 H2B-RFP 標記）在有絲分裂各時期的動態（如染色體分離、紡錘體形成），統計分裂周期時長。

亞細胞結構與功能動態：

細胞器互作：觀察線粒體（MitoTracker 標記）與內質網（ER-Tracker 標記）的接觸位點動態變化，研究鈣信號傳遞；

囊泡運輸：追蹤分泌囊泡（如 GFP 標記的胰島素顆粒）從高爾基體到細胞膜的運輸過程，分析運輸速率與調控機制。

細胞信號通路動態：

熒光共振能量轉移（FRET）實驗：通過 FRET 探針（如檢測 Ca2?的 Cameleon 探針），實時監測細胞內信號分子（如 Ca2?、cAMP）的濃度變化，反映信號通路激活狀態；

蛋白核轉位：觀察轉錄因子（如 NF-κB-GFP）在刺激（如細胞因子）作用下從細胞質到細胞核的轉位過程，分析通路激活時序。

疾病模型與藥物篩選：

腫瘤細胞凋亡：用 Annexin V - 熒光探針標記凋亡細胞，實時觀察藥物（如化療藥）處理后腫瘤細胞的凋亡動態，評估藥物起效時間與劑量效應；

病毒感染過程：用熒光標記病毒（如 GFP 標記的新冠病毒），追蹤病毒進入細胞、復制、釋放的全過程，研究感染機制。

五、使用注意事項：平衡成像質量與細胞活性

避免光毒性：熒光激發光（尤其是短波長紫外 / 藍光）會產生活性氧（ROS），導致細胞損傷（如 DNA 斷裂、凋亡）。需注意：

選擇最低有效激發光強度（如用 LED 光源替代汞燈，降低光功率）；

減少成像頻率（非必要不連續高頻成像）；

使用抗光漂白劑（如 Trolox），降低熒光分子光漂白速率。

無菌操作：腔室打開前需用 75% 乙醇消毒，樣品接種時避免污染；定期（如每周）用 UV 燈消毒腔室 30 分鐘，防止交叉污染。

培養基適配：

必須使用含碳酸氫鈉的培養基（如 DMEM），才能通過 CO?維持 pH 穩定；

若長時間成像（>48h），需補充培養基（或使用 perfusion 系統持續換液），避免營養耗盡。

樣品預處理：

細胞接種密度需適宜（如 6 孔板每孔 1-2×10?個細胞），避免成像時細胞過度匯合；

熒光標記需特異性強（如用特異性抗體標記，避免非特異性染色），減少背景信號干擾。

總結

培養箱內的倒置熒光顯微鏡并非 “顯微鏡 + 培養箱” 的簡單疊加，而是通過環境與光學的深度協同，解決了 “活細胞長時間動態成像” 的核心痛點 —— 既保證了熒光成像的高分辨率與特異性，又最大限度維持了細胞的生理活性，成為連接 “細胞靜態結構觀察” 與 “動態功能研究” 的關鍵橋梁，在基礎醫學和藥物研發中具有不可替代的作用。